鹽酸(suān)克侖(lún)特羅（瘦肉(ròu)）檢測(cè)試劑盒/（瘦(shòu)肉(ròu)）檢測試(shì)劑盒(hé)  型號(hào):DP-SRJ

   本(běn)試劑盒采用競(jìng)爭酶(méi)標(biāo)免疫法定(dìng)量(liáng)測(cè)定(dìng)尿(niào)，肌肉，肝髒及飼料中的克(kè)倫(lún)特羅及其(qí)他β興(xīng)奮(fèn)劑(jì)。試劑(jì)盒中包括了(liǎo)96個試驗(yàn)孔包(bāo)括標(biāo)準試驗及所有(yǒu)檢測用的試劑(jì)。如果行定量分(fēn)析，有微(wēi)孔板(bǎn)酶標(biāo)儀。
概要
     克侖特羅(luó)（clenbuterol，CLE）是種(zhǒng)腎上(shàng)腺受體激動(dòng)劑即神(shén)經興奮(fèn)劑，在(zài)臨床上(shàng)用(yòng)於(yú)治(zhì)療支氣管哮喘(chuǎn)，慢(màn)性支氣管(guǎn)炎和(hé)肺氣腫等(děng)疾病，因(yīn)此藥(yào)可(kě)以(yǐ)提(tí)瘦(shòu)肉(ròu)率，減少脂(zhī)肪(fáng)沉(chén)積(jī)和促(cù)動物生(shēng)長，被(bèi)些畜(xù)牧養殖企業作為養殖促劑(jì)非法使用。其(qí)殘留量可導(dǎo)致(zhì)人(rén)體肌(jī)肉(ròu)震顫，心悸，神經過敏，頭痛，目(mù)眩(xuàn)，惡心，嘔吐，發燒(shāo)，戰(zhàn)栗等(děng)症(zhèng)狀，對(duì)消(xiāo)費者的(dí)健康(kāng)有(yǒu)危(wēi)害。現(xiàn)已(yǐ)被(bèi)明令禁止用於(yú)養殖業。HPLC或GC-MS直用(yòng)作(zuò)檢(jiǎn)測β興奮(fèn)劑(jì)的方法，但(dàn)是(shì)其(qí)前處(chǔ)理步驟(zhòu)費用昂貴。酶聯(lián)免(miǎn)疫檢測(cè)試劑(jì)盒則可經(jīng)濟，快速(sù)地檢測尿，肌肉(ròu)，肝髒及飼(sì)料(liào)中的(dí)CLE。
測(cè)定原理
     測定(dìng)的基礎(chǔ)是抗原(yuán)抗體反應。微(wēi)孔板包被有針對(duì)CLE的兔抗體。經過洗(xǐ)滌步(bù)驟後，加(jiā)入(rù)CLE酶(méi)標(biāo)記物，標準或樣品(pǐn)溶(róng)液(yè)。CLE與CLE-酶標記物競爭(zhēng)抗(kàng)體，沒有連接的(dí)CLE-酶標記(jì)物在洗(xǐ)滌(dí)步(bù)驟中被除去(qù)。將酶反應底物(wù)（過氧(yǎng)化(huà)尿(niào)素）和(hé)顯色劑（四(sì)甲(jiǎ)基聯苯胺）加(jiā)入到孔(kǒng)中並且(qiě)孵(fū)育。結(jié)合的酶(méi)標(biāo)記(jì)物將無色的(dí)顯(xiǎn)色(sè)劑轉(zhuǎn)化(huà)為(wéi)藍色(sè)的產物。加(jiā)入反應(yīng)停止(zhǐ)液(yè)後使顏色(sè)由藍(lán)轉變(biàn)為黃(huáng)色(sè)。在450nm處(chǔ)測量，吸(xī)收(shōu)光(guāng)強度與樣(yàng)品中(zhōng)的(dí)CLE濃度成反比。
提供(gōng)的試(shì)劑（2-8℃保存）切勿冷凍
每個盒中的(dí)試劑足(zú)夠(gòu)行96個測量(liáng)（包括標準(zhǔn)分(fēn)析(xī)孔），盒中(zhōng)的材料如下(xià)：
       1×96孔板(bǎn)（12條×8孔(kǒng)）包(bāo)被(bèi)有兔IgG抗(kàng)體    
       6×標(biāo)準液(yè)，       （2ml）為分別(bié)含0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb 的(dí)CLE水溶液
       1×CLE過(guò)氧化物(wù)酶標記物(wù)濃(nóng)縮溶液(yè)     
       1×酶反(fǎn)應底物 （6ml）；含有(yǒu)過氧化尿素(sù)
       1×顯色(sè)劑         （6ml）;四甲(jiǎ)基(jī)聯苯胺
       1×反應停(tíng)止液 （7ml）；1M 硫(liú)酸(suān)
       1×PBS        （10ml）, 用於稀釋(shì)CLE-過(guò)氧(yǎng)化物酶標(biāo)記物(wù)濃縮溶(róng)液
       1×PBST濃縮液(yè)（40ml），加800ml蒸餾水稀(xī)釋，洗(xǐ)板(bǎn)用(yòng)
樣(yàng)品(pǐn)處(chǔ)理
    樣品(pǐn)處理(lǐ)方(fāng)法1
      組織，肉樣(yàng)（純肉(ròu)），內(nèi)髒樣(yàng)品的處理方法:
１．稱(chēng)2克(kè)匀漿過(guò)的樣(yàng)品加入2 mL溶液(yè)１（無色(sè)無味(wèi)），攪(jiǎo)拌或震蕩樣(yàng)品，使之混(hùn)合均匀。
2. 加(jiā)入6 ml溶(róng)液2（淡黃色(sè),具刺激性(xìng)氣(qì)味），推薦用(yòng)幹淨的衛(wèi)生筷(kuài)或竹簽(qiān)攪(jiǎo)拌樣品(pǐn)5分鐘(zhōng)；或(huò)振蕩(dàng)15分鐘(zhōng)，使其均(jūn)匀(yún)分布於溶液中(zhōng)。
3．3000g離(lí)心(xīn)10分(fēn)鐘。
4.  取3ml上(shàng)清(qīng)液於幹(gān)淨(jìng)平皿中,60℃恒溫箱(xiāng)蒸幹(gān)（30分(fēn)鐘左右(yòu)）；也可(kě)在試管中直接(jiē)水(shuǐ)浴加熱蒸幹。
5．殘(cán)留(liú)物用(yòng)1ml 溶液(yè)2 （無(wú)色無(wú)味） 衝洗(xǐ)溶(róng)解。
6．3000g離心(xīn)10分(fēn)鐘。
7．取(qǔ)清(qīng)亮中(zhōng)間(jiān)分50ul直接(jiē)加樣, ELISA行(háng)分析。
注(zhù)：如果(guǒ)不(bù)慎(shèn)將溶液(yè)弄到(dào)皮膚上(shàng)，請立即用７５％的用(yòng)酒(jiǔ)棉(mián)花擦拭，並用清水衝(chōng)洗(xǐ)。切勿飲用(yòng)及濺入眼睛。
 
     樣(yàng)品處理(lǐ)方法2                  （更快速）
1，稱(chēng)2克匀(yún)漿過的樣(yàng)品加(jiā)入2 mL溶液(yè)１（無色(sè)無味(wèi)），攪拌(bàn)或震(zhèn)蕩(dàng)樣(yàng)品，使之混合均(jūn)匀(yún)。
2，加(jiā)入4mL溶液(yè)2 （淡黃(huáng)色(sè),具(jù)刺(cì)激性(xìng)氣味(wèi)），強烈振蕩，肉樣(yàng)約2分(fēn)鐘，組(zǔ)織(zhī)約(yuē)6分鐘。
3，3000g離心5分鐘(zhōng)。
4，取(qǔ)1 ml上(shàng)清(qīng)液於幹淨平皿(mǐn)中(zhōng)，70℃~80℃恒(héng)溫箱蒸幹（約需(xū)5分(fēn)鐘左右）。或用(yòng)電(diàn)吹(chuī)風，隻需3分鐘(zhōng)。
5，殘(cán)留物(wù)用0.5 ml 溶液3 （無色(sè)無(wú)味(wèi)） 衝(chōng)洗，將底白色殘留物(wù)洗入溶(róng)液。
6，取洗脫液(yè)50ul作檢測用。
 
酶(méi)標免疫(yì)分析程序(xù)
1. 測定(dìng)之前(qián)注意(yì)事項
   a）  使(shǐ)用之(zhī)前將(jiāng)所有試劑回升至室(shì)溫20-25℃
   b）  使用(yòng)之(zhī)後立(lì)即將所(suǒ)有試(shì)劑放(fàng)回(huí)2-8℃
   c）  在(zài)使(shǐ)用中不(bù)要讓(ràng)微孔幹燥(zào)
   d）  在ELA分析中(zhōng)的(dí)重復(fù)性，很大程(chéng)度上(shàng)取(qǔ)決於洗板(bǎn)的*性，仔細按(àn)照(zhào)推(tuī)薦的(dí)洗(xǐ)板(bǎn)順(shùn)序操作是(shì)ELA測(cè)定程序中的要點(diǎn)
   e）  在所(suǒ)有恒溫(wēn)孵(fū)育過程中(zhōng)，避(bì)免(miǎn)光綫照射，用蓋子(zǐ)蓋住微(wēi)孔(kǒng)板(bǎn)
2.酶(méi)標(biāo)記(jì)物與(yǔ)微孔(kǒng)板條
   a） CLE- 酶(méi)標(biāo)記物 提供的CLE- 酶(méi)標(biāo)記物為濃縮(suō)液。由(yóu)於(yú)稀釋(shì)的酶標記(jì)物穩定(dìng)性不好，所(suǒ)以(yǐ)隻稀釋(shì)實際(jì)需(xū)用(yòng)量的(dí)酶標記物(wù)1：14稀釋（1μl酶(méi)標液(yè)加(jiā)14μlPBS）。在(zài)吸取濃縮液之前，要(yào)仔(zī)細(xì)地(dì)振搖，剩餘的仍(réng)放置2-8℃保(bǎo)存(cún)。
   b）微孔板(bǎn)條(tiáo)  取出需(xū)用(yòng)數量的(dí)微孔板及框(kuàng)架(jià)，將不用(yòng)的微孔板用膠帶(dài)封好(hǎo)，放(fàng)原袋(dài)中(zhōng)重新(xīn)密(mì)封(fēng)，4℃或-20℃保(bǎo)存，謹防(fáng)受(shòu)潮(cháo)。
3. 標準(zhǔn)液    提供(gōng)的CLE標(biāo)準液濃(nóng)度為0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb（ng/ml）
4. 測(cè)定(dìng)程(chéng)序（室溫25℃條件(jiàn)下(xià)操(cāo)作）
   a） 剪開(kāi)鋁箔袋(dài)，將(jiāng)足(zú)夠標(biāo)準和樣(yàng)品所用數(shù)量(liáng)的(dí)孔(kǒng)條(tiáo)插(chā)入微(wēi)孔架，標準和(hé)樣(yàng)品(pǐn)做兩個平行(háng)實(shí)驗(yàn)，記(jì)錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置(zhì)。加(jiā)入20μl的(dí)標準液或(huò)處理好的樣品(pǐn)到各(gè)自的微孔中(zhōng)。如果微孔(kǒng)板條(tiáo)次(cì)實驗用(yòng)不(bù)，放(fàng)回原(yuán)鋁箔(bó)袋中封(fēng)緊，再(zài)套(tào)個塑料自封(fēng)袋(dài)夾緊(jǐn)後4℃或(huò)-20℃保存(cún)，切忌受(shòu)潮(cháo)。
   b） 加(jiā)入(rù)100μl稀釋(shì)的酶標(biāo)記物到微孔底(dǐ)，25℃孵育(yù)30分鐘（推薦使(shǐ)用(yòng)恒(héng)溫箱）。
   c） 倒出(chū)孔中的液體(tǐ)，將(jiāng)微(wēi)孔架(jià)倒(dǎo)置在(zài)吸水紙(zhǐ)上(shàng)拍(pāi)打(dǎ)（每行(háng)拍(pāi)打3次(cì)）以保證(zhèng)除去孔中(zhōng)的(dí)液體(tǐ)，用250μl PBST充入(rù)孔(kǒng)中，再次(cì)倒掉(diào)微孔(kǒng)中液體，再(zài)重復操作(zuò)兩次(cì)。每次(cì)洗(xǐ)板(bǎn)應加(jiā)入洗液後(hòu)等(děng)2分鐘(zhōng)再(zài)倒掉。推(tuī)薦使用洗(xǐ)瓶(píng)洗板，這樣(yàng)可加(jiā)快速(sù)度，避(bì)免板條間的孵育時間不*而產生OD值的(dí)差(chà)異。
   d） 反應底物與(yǔ)顯色試(shì)劑以(yǐ)1：1混(hùn)合後加入100μl到微(wēi)孔中，充分(fēn)混合並在25℃暗處(chǔ)孵(fū)育15分鐘(zhōng)。
   e） 加(jiā)入50μl反應停止液(yè)到(dào)微孔(kǒng)中(zhōng)，混(hùn)合(hé)好在450nm 處測量吸光度值，在加(jiā)入(rù)停止液後(hòu)10分鐘(zhōng)內(nèi)讀取(qǔ)光(guāng)度(dù)值。
結果
     所(suǒ)獲得(dé)的(dí)標準和(hé)樣(yàng)品吸(xī)光(guāng)度值的平均值(zhí)除(chú)以(yǐ)*個標準（0標準）的吸(xī)光度值再乘以100，因此(cǐ)0標(biāo)準等於(yú)並且以百分比的形式給出(chū)吸(xī)光(guāng)度(dù)值(zhí)。
 
               標準(zhǔn)的吸光(guāng)度值(zhí)（或樣品）
              ----------------------- ×100 =  %吸光度(dù)值
                    0標(biāo)準的(dí)吸光度(dù)值
 
計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成(chéng)為個對(duì)應(yīng)CLE濃度(dù)（ng/g,或ng/ml）的半(bàn)對(duì)數(shù)坐標(biāo)係統(tǒng)曲綫(xiàn)圖，校正曲綫(xiàn)在0.2-2ng/g（ppb）範(fàn)圍(wéi)內應當成(chéng)為(wéi)綫(xiàn)性(xìng)。相對應(yīng)每個樣(yàng)品的(dí)濃度(dù)（ng/g, 或(huò)ng/ml）可以(yǐ)從校正(zhèng)曲綫(xiàn)上讀出(chū)。
靈敏度
     克倫特(tè)羅(luó)測定試劑(jì)盒(hé)的平均檢(jiǎn)測(cè)下(xià)限約為(wéi)0.1ng/g（0.1ppb）。
特異(yì)性(xìng)
   與克(kè)倫(lún)特(tè)羅類(lèi)似(sì)物的交叉反應(yīng)：
      克(kè)倫特(tè)羅（Clenbuterol）                                           
      溴(xiù)布特(tè)羅（brombuterol）            110%
      塞(sāi)布(bù)特(tè)羅(luó)（cimbuterol ）              40%                           
      馬噴(pēn)特(tè)羅（mapenterol）              17%
      馬布特羅（mabuterol）               16%                                    
      沙丁(dīng)胺醇（salbutamol）               9%
      妥(tuǒ)布特羅(luó)（tulobuterol）               2%                                                                      特布他林(lín)（terbutalin）                 2%
      萊(lái)克多巴胺                             <1%                      
     異(yì)丙(bǐng)腎(shèn)上腺(xiàn)素(sù)（Isoproterenol）       <1%
      腎上腺素（Adrenalin ）                <1%                                  
     去(qù)甲(jiǎ)腎(shèn)上腺素(sù)（Noradrenalin）         <1%
 
回收(shōu)率
       回收率(shuài)為90%±15%